脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程
Rules for virus detection of virus-free see d (s eedling)s weetp otatoes
2000一09一22發(fā)布2000一12一01實(shí)施
中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布 NY/T 402-2000
前言
為 了有 效 地實(shí)施對(duì)脫毒甘薯種薯(苗)質(zhì)量檢驗(yàn)和管理，規(guī)范脫毒甘薯種薯(苗)市場(chǎng)，促進(jìn)甘薯脫毒
技術(shù)推廣，實(shí)現(xiàn)脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測(cè)的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，特制定本規(guī)程。本規(guī)程在參照國(guó)內(nèi)外甘薯
病毒檢測(cè)技術(shù)最新研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，結(jié)合當(dāng)前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)實(shí)際，力求達(dá)到快速、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)的檢測(cè)
要求。檢測(cè)對(duì)象主要選擇生產(chǎn)上發(fā)生分布范圍廣、危害性大的病毒。檢測(cè)方法主要采用指示植物檢測(cè)和
斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法。
本 規(guī) 程 內(nèi)容包括脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測(cè)的適用范圍、檢測(cè)對(duì)象、抽樣方法、檢測(cè)方法和質(zhì)量
要求。
本 標(biāo) 準(zhǔn) 的附錄A、附錄B都是標(biāo)準(zhǔn)的附錄。
本 標(biāo) 準(zhǔn) 由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。
本 標(biāo) 準(zhǔn) 主要起草單位:農(nóng)業(yè)部植物脫毒種苗質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(濟(jì)南)、山東省植物保護(hù)總站。
本 標(biāo) 準(zhǔn) 主要起草人:孫作文、商明清、李明立、劉敬東、楊勤民、任寶珍。
中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程
NY/T 402-2000
Rules for virus detection of virus-free
se ed ( seedling)s weetp otatoes
1 范圍
本 標(biāo)準(zhǔn) 規(guī) 定了脫毒甘薯種薯(苗)的病毒檢測(cè)方法和操作規(guī)程。
本 標(biāo)準(zhǔn) 適 用于脫毒甘薯種薯(苗)的病毒檢測(cè)。
2 定義
本 標(biāo) 準(zhǔn) 采用下列定義。
2.1 脫毒苗
應(yīng)用 莖 尖 組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的再生試管苗，經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)不帶甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)和甘落潛
隱病毒(SPLV)，才確認(rèn)是脫毒苗。
2.2 脫毒種薯(苗)
從繁 殖 脫 毒苗開(kāi)始，經(jīng)逐代繁殖增加種薯(苗)數(shù)量的種薯(苗)生產(chǎn)體系生產(chǎn)出來(lái)的。分原原種、原
種、生產(chǎn)用種三個(gè)級(jí)別。
2.2.1 原原種pre-elite
用脫 毒 苗 在防蟲(chóng)網(wǎng)室、溫室條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯(苗)。
2.2.2 原種elite
用 原 原 種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯(苗)。
2.2.3 生產(chǎn)用種certified seed or seedling
用原 種 作 種薯，在隔離條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯(苗)。
2.3 病毒病株允許率
指各 級(jí) 甘 薯種薯(苗)繁殖田中病毒病株的允許比率。
3 檢測(cè)對(duì)象
甘薯 羽 狀 斑駁病毒(Sweetp otatof eatherym ottlev irus,SPFMV)=
甘薯 潛 隱 病毒(Sweetp otatol atentv irus,SPLV),
4 抽樣
41 組培苗抽樣
4.1.1 脫毒核心材料:每株必須檢測(cè)。
4.1.2 擴(kuò)繁苗:隨機(jī)抽取l 0 o-2%的擴(kuò)繁苗檢測(cè)。
4.2 田間抽樣
4.2.1 原原種和原種抽樣:定植后30天、60天、收獲前2周，在目測(cè)全田的基礎(chǔ)上，采用五點(diǎn)取樣法，
中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部200。一09.一22批準(zhǔn)2000-12一01實(shí)施
t
NY / T 40 2- 2 00 0
抽樣數(shù)量為。.1 h m'以下200株;o.11 一 1h m2500株;超出1h m'面積，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本規(guī)程規(guī)定
的面積取樣。每株取上、中、下部葉片1-5 g，低溫保濕存放，24 h內(nèi)檢測(cè)。
4.2.2 生產(chǎn)用種抽樣:定植后30天、收獲前兩周，在目測(cè)的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)取樣法，0. 1 hm2以下檢
驗(yàn)2點(diǎn)，每點(diǎn)100株;0.11^-1 hm，檢驗(yàn)五點(diǎn)，每點(diǎn)100株;1.1^-5 hm，檢驗(yàn)10點(diǎn)，每點(diǎn)100株;超出
5 hm，面積，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本規(guī)程規(guī)定的面積取樣。取樣方法及樣品保存同4.2.1,
4.3 商品種薯(苗)抽樣
沒(méi)有 經(jīng) 過(guò) 田間檢驗(yàn)的種薯(苗)必須進(jìn)行塊根或種苗檢驗(yàn)。
4.3.1 根據(jù)甘薯種薯(苗)不同存放方式，采用分層設(shè)點(diǎn)取樣或隨機(jī)取樣，抽樣數(shù)量見(jiàn)表1,
表 1 抽 樣 數(shù) 量 標(biāo) 準(zhǔn) 表
種類種薯(苗)總量抽樣百分率,% 抽樣最低數(shù)量
薯苗
c10 000株6--10 100株
>10 000株3. 5
種薯
簇1o ooo kg 6- 10 loo kg
>10 000 kg 3- 5
注不足抽樣最低數(shù)量的全部作為混合樣品。
2 將第一次抽取的樣品混合后，進(jìn)行二次抽樣，隨機(jī)抽取10%的混合樣品檢測(cè)。
5 檢測(cè)方法
5.1 X點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附(Dot-ELISA )檢測(cè)法
用 于 檢 測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒和甘薯潛隱病毒，檢測(cè)方法見(jiàn)附錄A,
5.2 指示植物檢測(cè)法
用 于 輔 助檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒和甘薯潛隱病毒，檢測(cè)方法見(jiàn)附錄B,
檢 測(cè) 甘 薯病毒的指示植物及癥狀見(jiàn)表2,
表 2 檢 測(cè) 甘 薯 病 毒 的 指 示 植 物 及 癥 狀
病 毒 種 類 } 指示植物}
SPFM V
SPLV
巴西牽牛
巴西牽牛
癥狀
羽狀斑駁
葉脈變黃
6 質(zhì)t要求
凡斑 點(diǎn) 酶 聯(lián)免疫吸附檢測(cè)或指示植物檢測(cè)呈陽(yáng)性者為帶毒薯(苗)。
原 原 種 :病毒病株允許率是。。
原種 : 病 毒病株允許率-<2.。%。
生產(chǎn) 用 種 :病毒病株允許率(10000
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(標(biāo) 準(zhǔn) 的 附錄)
斑點(diǎn)酶聯(lián)免痊檢測(cè)法
Al 溶液配制
所 用 化 學(xué)試劑為分析純級(jí)規(guī)格，用水為蒸餾水。
Al.1 三經(jīng)甲基氨基甲烷(TBS)(p H7.5 )
Tr is base 4 .8 4g
氯化 鈉 ( NaCI) 58 .4 4 g
疊氮 鈉 ( NaN,) 0. 4 0 g
溶于 19 90m L蒸餾水中，用鹽酸(37%)調(diào)pH至7.5，定容至20 00m L,
A1.2 洗滌緩沖液(TTBS)
1. 0 m L 吐溫一20(Tween-20)溶于20 00m LT BS中。
Al. 3 抽提緩沖液
亞硫 酸 鈉 (NazSOO0.20 g 溶于TBS中.定容至100m L,
A1.4 封閉緩沖液(現(xiàn)用現(xiàn)配)
脫脂 奶 粉 0.5 0g
粹 通 X -100(TritonX -100) 0.5 m L
T BS 2 5 m L
先將 脫 脂 奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至25m L。加人TritonX -100混合均勻。
Al.5 抗體稀釋緩沖液
脫脂 奶 粉 1.00 g
T BS 50 mL
先將 脫 脂 奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至50m L.
Al. 6 底物緩沖液(pH9. 5 )
Tr is base 6 .0 5g
氯化 鈉 ( NaCI) 2. 92 g
氯化 鎂 ( M9C12·6H20) 0.5 1 g
疊氮 鈉 ( NaN,) 0. 05 g
溶于 450 m L蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH值至9.5，定容至500m L,
Al- 7 硝基藍(lán)四哇鹽(NBT)和5-PA-4-X-3-991*磷酸醋(BCIP)儲(chǔ)備液
NB T 儲(chǔ) 備液:
NB T 0 .0 4 g
70 % N, N一二甲基甲酞胺1.2 m L
混 合 均 勻，4'C避光保存。
BC IP 儲(chǔ) 備液:
BC IP 0 .0 2 g
70 % N, N一二甲基甲酞胺l.2 m L
混 合 均 勻，4'C避光保存。
A1. 8 底物溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)
底 物 緩 沖液25m L
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NB T 儲(chǔ) 備液75p L
BC IP 儲(chǔ) 備液75K L
先 將 N BT儲(chǔ)備液溶于25m L底物緩沖液中，再逐滴加入BCIP儲(chǔ)備液，邊加邊振搖混勻。
A2 樣品制備
將 待測(cè) 葉 片用清水清洗千凈，從每一樣品葉片上各取一直徑約1c m圓片，放人樣品袋中，加入
3 mL抽提緩沖液充分研磨.4℃靜置30^-40 min，取澄清汁液點(diǎn)樣。樣品為塊根時(shí)催芽處理后取幼芽、葉
制樣。
A3 操作步驟
A3.， 點(diǎn)樣:將打好方格的硝化纖維素膜用TBS緩沖液處理后放在潔凈的濾紙上，每個(gè)樣品各吸取
17 ftL上清液滴在膜上方格的正中，干燥15^30 min。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，可根據(jù)需要設(shè)置重
復(fù)。
A3.2 封閉:將干燥后的膜浸泡在封閉緩沖液中，室溫下?lián)u床振蕩(50 r/min)1 h,
A3.3 孵育第一抗體:將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗血清中，室溫下?lián)u床振蕩(50r /min)
過(guò)夜。
A3.4 洗滌:用洗滌緩沖液洗膜3次，每次搖床振蕩(100 r/min)3 min.
A3.5 孵育第二抗體:將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)抗體中，室溫下?lián)u床振蕩
(50 r/min)1 h,
A3.6 洗滌:洗滌4次，方法同A3.4.
A3.7 顯色:將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室溫下?lián)u床振蕩(50 r/min)孵育30 min.
A3. 8 終止反應(yīng):棄去底物溶液并用燕餾水洗膜3次，每次搖床振蕩(100 r/min)3 min.
A3.9 陽(yáng)性判斷:晾干后觀察顏色反應(yīng)，出現(xiàn)藍(lán)紫色顏色反應(yīng)的樣品為陽(yáng)性。
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附 錄B
(標(biāo) 準(zhǔn)的附錄)
指示植物檢測(cè)法
B1 錄育指示植物
在 防 蟲(chóng) 條件下盆栽巴西牽牛，至1-2片真葉時(shí)嫁接。
以待 測(cè) 樣 品的莖蔓為接穗，巴西牽牛為砧木，在巴西牽牛的莖部(子葉以下)斜切。將待檢樣品莖蔓
切成3^-5段，每段帶有至少一個(gè)腋芽，去葉后將底端削成楔型，插入砧木的切口內(nèi)，用封口膜扎緊，置
26-32℃防蟲(chóng)網(wǎng)室內(nèi)遮蔭保濕2-3夭。每個(gè)樣品重復(fù)3-5次。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。嫁接10^-
15天后觀察記載癥狀。
B3 陽(yáng)性判斷
根 據(jù) 指 示植物癥狀，確定病毒有無(wú)及種類。在所有嫁接的指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀，該
樣品即為陽(yáng)性。
